Après avoir servi au côté de Captain America durant la Seconde Guerre mondiale, elle reste bouleversée par la disparition de Steve Rogers et est un agent de la SSR, mais souvent reléguée au simple rôle de secrétaire par ses collègues.

Après plusieurs téléfilms, elle obtient son premier rôle au cinéma dans Le Rêve de Cassandre de Woody Allen aux côtés d'Ewan McGregor et Colin Farrell.

En 2008, elle apparait dans The Duchess avec Keira Knightley.

En 2010, elle est choisie pour incarner Peggy Carter dans Captain America: First Avenger, rôle qu'elle reprend également dans Captain America: Le soldat de l'hiver, Avengers : L'Ère d'Ultron et Ant-Man.

Le 9 mai 2014 Marvel et ABC annoncent la série Marvel's Agent Carter, dont Hayley sera l’héroïne. Une deuxième saison a été annoncée en mai 2015.

Hayley Atwell est également apparue à la télévision dans la mini-série Les Piliers de la terre (adaptée du roman éponyme de Ken Follett), où elle a interprété le rôle d'Aliena.

En 2012, l'actrice tourne dans le biopic consacré à Jimi Hendrix, All Is by My Side, de John Ridley, aux côtés d'André 3000 (Outkast). Elle joue le rôle de Kathy Etchingham, la petite amie du guitariste durant ses premières années à Londres.